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技術原理

   CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic圖片關鍵詞 Repeats)是最新出現的一種由sgRNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在這一系統中,sgRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA 進行修飾的目的。CRISPR/Cas9系統能夠對小鼠基因組特定基因位點進行精確編輯,目前瑞思元已經成功將此技術應用于小鼠基因敲除/敲入模型制備,以及條件性敲除(Loxp系統)模型制備。      

      目前瑞思元采取優化過的野生型Cas9和雙切口Cas9n(Optimized Cas9 System,OCAS and OCASn)。采用優化過的雙切口Cas9n(OCASn)可以將脫靶效應降到最低。


常規基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技術,針對靶基因設計、構建相應的gRNA質粒和donor質粒,通過Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重組,引入特定的突變、報告基因(如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等)需要表達的功能性cDNA(如cre、Dre等)到目的基因的特定位點。

圖片關鍵詞


條件性基因敲入

利用CRISPR/Cas9基因敲入技術,針對靶基因設計、構建相應的gRNA質粒和donor質粒,將外源基因或特定突變敲入引入到基因組目的基因的特定位點。

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Rosa26位點定點敲入

     根據Rosa26基因序列設計合成sgRNA,將構建包含同源序列和目的序列的片段與Cas9、sgRNA共同顯微注射入受精卵中,Cas9/sgRNA復合體與基因組靶序列結合并切割雙鏈DNA,以含目的片段的同源序列為模版修復基因組DNA,最終獲得在Rosa26基因intron中定點插入片段的大小鼠。

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制備流程圖片關鍵詞

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